مراحل PCR

مراحل PCR:

1.  مرحله شروع (Initialization step): به مدت ۱ تا ۹ دقیقه دمای محلول به ۹۴ تا ۹۶ درجه (یا ۹۸ درجه اگر پلیمرازها کاملا به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روش hot-start PCR هستند.

۲٫  مرحله واسرشت (Denaturation step): این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه در دمای ۹۴ تا ۹۸ درجه است. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا میشوند و تک رشته های DNA حاصل میگردد.

۳٫  مرحله اتصال (Annealing step): دمای محلول به مدت ۲۰ تا ۴۰ ثانیه به ۵۰ تا ۶۵ درجه کاهش می یابد. در این مرحله پرایمرها به تک رشتهای DNAی الگو متصل میشوند. بطور طبیعی، دمای اتصال (Annealing temperature) در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل میگیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر-الگو، همانند سازی DNA را آغاز میکند.

۴٫  مرحله طویل شدن (Extension/elongation step): دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود ۷۵ الی ۸۰ درجه است که معمولا دمای ۷۲ درجه انتخاب میشود. در این مرحله آنزیمDNA پلیمراز با استفاده از dNTP های موجود در محلول، یک رشته DNAی جدید را در جهت َ۵ به َ۳ و در مقابل رشته های الگو میسازد. مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه مینماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر میشود. بنابر این در هر سیکل PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد.

۵٫  مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام میشود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.

۶٫  نگهداری نهایی (Final hold): در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

۷٫  الکتروفورز در ژل آگارز: نهایتا میتوان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی (DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) الکتروفورز نمود، تا صحت انجام PCR بررسی شود.

PCR

   PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر ۱۰ کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد. 

کاربردهای PCR

بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از:

- کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی،

- فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، 

- تشخیص بیماریهای ارثی

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

   در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن  دمای محلول  به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)،  رشته الگو (DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ۳ در  مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبتⁿ2 افزایش می یابد که n  تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود.